ESTANDARIZACIÓN
DE LAS CONDICIONES PARA LA SEPARACIÓN
ELECTROFORÉTICA DE PRODUCTOS
AMPLIFICADOS
POR MICROSATÉLITES EN MATERIALES DE PAPA
Martha Osorio
D,
Ariadne Vegas García y Alexis Marques
1Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas
del Estado Mérida (CIAE-Mérida)
Avenida Urdaneta, Edificio INIA-Mérida
al lado del MAT Mérida – Venezuela
Tlf: 0274- 2630090
2Instituto Nacional de Investigaciones
Agrícolas
Centro Nacional de
Investigaciones Agrícolas
(INIA-CENAIP). Av. Limón, Área Universitaria
Maracay-Aragua
La
posibilidad de identificación rápida y exacta de clones de papa (Solanum
tuberosum L), es importante para los programas de mejoramiento genético,
para los productores de papa semilla y de consumo y para la comercialización
y utilización de los cultivares de papa. Con la tipificación genética
basada en el uso de ADN y utilizando repeticiones de secuencias simples (SSRs
o microsatélites) se ha demostrado la existencia de diferencias entre
clones de papa (Norero y col., 2003; Ispizua y col., 2003).
Esta técnica ha distinguido en forma
precisa y eficiente clones de papa diploides, triploides y tetraploides
con un polimorfismo amplio, convirtiéndose en un sistema de tipificación
genética aplicada. Para su implementación requiere de la estandarización,
en los laboratorios, de las condiciones de amplificación y separación
electroforética de los productos amplificados, con respecto a este último,
el sistema preferido y mas ampliamente recomendado para la separación
electroforética de los productos de amplificación por microsatélites es
la poliacrilamida (PAGE), sin embargo, en estudios recientes utilizando el
sistema PAGE y el de agarosa, no sólo se observaron polimorfismos en
ambos geles, sino que además el gel de agarosa fue capaz de diferenciar
los clones sometidos a estudio tal como lo hizo el PAGE. Por tanto, se ha
indicado que aunque el
sistema PAGE es el preferido para la identificación de variedades, la
agarosa puede ser utilizada para diferenciar líneas, cuando se necesitan
comparaciones varietales específicas (Douches y col., 2004).
El objetivo del trabajo fue la estandarización
de las condiciones para la separación electroforética de los productos
de amplificación por microsatélites de los materiales de papa del Banco
de Germoplasma in vitro del
INIA-Mérida, para ello se probaron geles de poliacrilamida y agarosa en
diferentes concentraciones y condiciones, observándose que la agarosa aun
cuando no está recomendada para estudios de diversidad genética en papa,
permitió la separación de manera precisa y reproducible de los
materiales de papa estudiados.
Palabras
clave: SSR, Solanum tuberosum L,
electroforesis, PAGE, agarosa
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Para la separación de los productos
amplificados se probaron geles de poliacrilamida en concentraciones de 6%
y 8%, ambos con y sin desnaturalizado (SDS 10%), éstos fueron corridos
en tampón TBE 0,5X durante una hora y luego teñidos con Bromuro de etidio
a razón de 10 mg/ml (figuras 1 y 2). Así mismo, se probaron geles de
agarosa 3% (p/v) provenientes de agarosa de diferentes composiciones, una
con bajo punto de electroendósmosis (Agarosa GQT) y otra especialmente
diseñada para la separación de productos de PCR y fragmentos pequeños
de ácidos nucleicos generados por digestión enzimática (Agarosa NU
Micropor MS8). Los geles de ambos tipos de agarosa fueron preparados tanto
en tampón TBE (Tris base, ácido bórico y EDTA 0,5 M pH 8,3) como en
tampón TAE (Tris base, ácido acético glacial y EDTA pH 8,3) en
concentraciones de 0,5X y 1X cada uno, mezclados con bromuro de etidio (10
mg/ml) y probados en tampón
de corrida 0,5X y 1X en las siguientes combinaciones: geles preparados en
tampón TBE 0,5X corridos en tampón TBE 0,5X y 1X respectivamente; geles
preparados en tampón TBE 1X corridos en tampón TBE 0,5X y 1X; geles
preparados en tampón TAE 0,5 X corridos en tampón TAE 0,5X y TAE 1X y
finalmente geles preparados en tampón TAE 1X corridos en tampón 0,5X y 1X)
todos estos geles se sometieron a condiciones de corrida de 100 V, 45 mA y
5 vatios durante tres horas y 30 minutos (Figuras 3 y 4). Para el proceso
de estandarización de las condiciones de separación electroforética de
los productos amplificados, se utilizó la metodología de amplificación
por microsatélites establecida por Osorio, 2005 (datos no publicados) con
ADNs provenientes de cuatro materiales in
vitro del Banco de Germoplasma del INIA-Mérida (Monserrate, Fripapa,
Tibisay y María bonita) y el iniciador STM-1104 (Bio Source, corp).
| Selección del sistema electroforético para la separación de los productos amplificados |
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| GEL SIN DESANURALIZADO | GEL CON DESNATURALIZADO |
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Figura 1. Geles de poliacrilamida (PAGE) 6% sin y con desnaturalizado |
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| Gel sin desnaturalizado | Gel con desnaturalizado |
| Figura 2. Geles de poliacrilamida (PAGE) 8% sin y con desnaturalizado | |
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Agarosa GQT |
Nu Micropor MS8 |
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Figura 3. Geles de agarosa GQT y Nu Micropor MS8 3% en tampón TBE 1X. |
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Agarosa GQT |
Nu Micropor MS8 |
| Figura 4. Geles de agarosa GQT y Nu Micropor MS8 3% en tampón TAE 1X | |
De los sistemas electroforéticos probados para la separación de los
productos amplificados, la agarosa NU Micropor MS8 en concentración de 3%
(p/v) preparada en tampón TBE 1X y corrida en TBE 0,5X, en las condiciones
de corrida antes señaladas, permitió la separación clara, precisa y
reproducible de los materiales sometidos a estudio (Figura 5).
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| Figura 5. Gel de agarosa Nu Micropor MS8 3% |
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La identificación rápida y precisa
de clones de papa (Solanum tuberosum
L) es importante para los programas de mejoramiento genético, para los
productores de papa semilla y consumo y para la comercialización.
Con el uso de los microsatélites, se ha
distinguido en forma precisa y eficiente clones de papa con un
polimorfismo amplio, convirtiéndose en un sistema de tipificación genética
aplicada. Para su implementación se requiere la estandarización, en los
laboratorios, de las condiciones de amplificación y separación
electroforética de los productos amplificados, con respecto a este último,
el sistema preferido y mas ampliamente recomendado para la separación
electroforética de los productos de amplificación por microsatélites es
la poliacrilamida (PAGE), sin embargo,
en estudios recientes en los cuales se utilizaron tanto el sistema
PAGE como el de agarosa, no sólo observaron polimorfismos en ambos geles,
sino que además la agarosa fue capaz de diferenciar los
clones tal como lo hizo el PAGE, por tanto, se ha indicado que
aunque el sistema PAGE es el preferido para la identificación de
variedades, la agarosa puede ser utilizada para diferenciar líneas,
cuando se necesitan comparaciones varietales específicas.
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Douches, D. S.,
J. J. Coombs L. M. Frank. 2004.
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Ghislain, M., D. M. Spooner; F. Rodríguez;
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Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs)
for genotyping of cultivated potato. Theor. Appl. Genet . 108: 881-890.
Ispizúa, V., Clausen, A, Guma, R y
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de la diversidad genética en variedades nativas de Solanum tuberosum L.
ssp. Andígena mediante la utilización de microsatélites. Unidad
integrada Facultad de Ciencias Agrarias. UNMdP-EEA-Balcarce. INTA.,
CC.276. Balcarce-Buenos Aires, Argentina. Biología Molecular y Genética.
www.biologia.org
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2003. Microsatélites: Potente herramienta para la identificación de
cultivares de papa. In: IV Simposio de Recursos Genéticos para América
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L) mediante amplificación de
microsatélites. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA),
CC276, Balcarce-Buenos Aires, Argentina. Biología Molecular y Genética. www.biologia.org
Referencia de este artículo:
Osorio, M.; Vegas, A. y Márquez, A.
2005. Estandarización de las
condiciones para la separación electroforética de productos amplificados
por microsatélites en materiales de papa. Revista Digital
CENIAP HOY Número 8 2005. Maracay, Aragua, Venezuela.
URL:
www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n8/arti/osorio_m/osorio_m.htm
Visitado en fecha:
DERECHOS
RESERVADOS ® 2003 REVISTA DIGITAL CENIAP HOY
ISSN:
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INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS (INIA-CENIAP)
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Negociación, Venezuela