2.  Propagacion in vitro de clones seleccionados

	Planta completa
	Segmentos nodales
	Yema Axilar
	Planta adulta
Obtención de segmentos nodales

El medio de cultivo para la regeneración de plantas a partir de microestacas está compuesto por los nutrimentos necesarios para el crecimiento de las plantas, principalmente macro y micronutrimentos, fuentes de carbono, vitaminas y reguladores de crecimiento. Para la propagación de los clones de yuca se utiliza la composición básica del medio de cultivo Murashige y Skoog (1962), con las siguientes modificaciones: las sales minerales se diluyen a un cuarto de su concentración, la tiamina a la mitad de su concentración y se duplica la concentración de la solución de hierro; se agrega como regulador de crecimiento una auxina sintética, el ácido naftalenacético (ANA) 0,02 mg/l y agar 7 g/l.

El pH del medio de cultivo se ajusta a 5,8 previo a la adición del agar. Una vez agregado el agar y fundido en una plancha de calentamiento con agitación, se distribuye el medio de cultivo en los frascos con tapa. Posteriormente se esterilizan en un autoclave durante 20 minutos a una temperatura de 120 °C y 15 psi de presión durante 20 minutos.

El agar es un agente gelificante inerte que sirve de soporte a los segmentos nodales y no interfiere en la movilización de nutrimentos desde el medio de cultivo hasta el tejido vegetal.

Después de dos meses de cultivo se obtienen plantas desarrolladas (con vástagos y raíces) listas para ser aclimatadas. Las plantas regeneradas adquieren buen vigor y una longitud del tallo que varía entre tres y 10 cm. Durante el periodo de cultivo se debe controlar la aparición de agentes contaminantes en los frascos de cultivo y eliminarlos inmediatamente.

Todos los clones provenientes del CIAT y el clon local Sardina regeneran plantas bajo las condiciones experimentales expuestas, aunque los porcentajes de regeneración varía entre los clones. La mayoría de los clones presentan porcentajes de regeneración relativamente altos entre 70 y 90%, incluyendo el clon Sardina (74%) y los más bajos corresponden a PER 183 (60%), CM5306-8 y CM7073-7 (65%).

La composición del medio de cultivo es de gran importancia para que ocurran los procesos morfogenéticos necesarios en el evento de regeneración de las plantas y entre ellos, los reguladores de crecimiento juegan un papel muy importante. El Acido naftalenacético (ANA), a la concentración de 0,02 mg/l, favorece la formación de plantas completas de yuca sin formación indeseable de callo. La formación de callo dificulta el crecimiento de vástagos y raíces.

 

	Plantas de yuca regeneradas in vitro creciendo en el cuarto climático.

2.5.  Aclimatación y siembra en condiciones de umbráculo

La aclimatación es un proceso de adaptación gradual de las vitroplantas crecidas en condiciones controladas de luz, temperatura, humedad y nutrimentos hacia condiciones naturales. Esto les proporciona mayor capacidad para soportar los cambios climáticos y la disponibilidad de nutrimentos en el suelo.

El procedimiento es el siguiente:

· Abrir gradualmente durante siete días las tapas de los frascos de las plantas desarrolladas (con más de 5 cm de longitud).

· En el cuarto de aclimatación se extraen las plantas con una pinza larga y se lavan los restos de agar con agua corriente.

· Las plantas se colocan en vasos plásticos pequeños con agua corriente y dentro de una bandeja de plástico tapada con una bolsa plástica transparente. La bandeja se coloca en condiciones de fotoperíodo de 16 h diarias de luz durante siete días.

 

	Plantas de yuca regeneradas in vitro aclimatadas en vasos plásticos con agua corriente y contenidas en una bandeja en condiciones de umbráculo.

· Se reemplaza el agua corriente por una solución nutritiva rica en nitrógeno, fósforo y potasio (Guo y Liu, 1994) durante siete días y se colocan las bandejas en una zona del umbráculo con exposición indirecta a la luz solar. Esta solución nutritiva promueve el crecimiento vigoroso de las plantas.

· Las plantas se siembran y se mantienen en condiciones de umbráculo durante 22 a 30 días en materos conteniendo sustrato estéril compuesto de aserrín de coco, tierra y arena en la proporción 1:1:1. Se agrega fertilizante foliar (15-5-32) a 5 %.

 

Plantas de yuca sembradas en matero y creciendo en condiciones de umbráculo

Es importante el uso de un sustrato poroso con buen drenaje y previamente esterilizado para disminuir los riesgos de infestación.

El porcentaje de sobrevivencia por clon durante el periodo de siembra en umbráculo es superior al 50%, excepto para los clones CM 5306-8 (37,5%) y PER 183 (40%).

Para un crecimiento óptimo de las plantas en el umbráculo es necesario agregar fertilizante y regarlas al menos 2 veces por semana.

La aclimatación es la fase determinante para el éxito del proceso de propagación. Tiempos cortos de aclimatación pueden producir altas tasas de mortalidad.

2.6.  Siembra en campo

Las plantas son trasladadas en los materos hasta el campo experimental. La siembra se realiza en surcos con una separación de 1 m y una distancia entre plantas de 0,80 m.

· La planta se extrae del matero, se coloca en el hoyo y se cubren las raíces con suficiente tierra verificando que la planta se mantenga en posición vertical.

· El riego se debe efectuar al finalizar la siembra y posteriormente 1 vez por semana dependiendo de la época de siembra. 

En época seca se recomienda regar 2 veces por semana.

Durante las primeras cuatro semanas de la siembra se debe controlar la presencia de malezas para evitar su competencia con el cultivo.

	Plantas de yuca vigorosas sembradas en el campo

El porcentaje de sobre vivencia en el campo se ubica entre 22,2 y 100 %. El más alto corresponde al clon CM 6438-14  y el más bajo para el CM 5306-8. El clon CM 5306-8 presenta el porcentaje más bajo de sobre vivencia tanto en aclimatación en umbráculo como en el campo.

La principal causa de mortalidad de las vitroplantas durante el proceso de aclimatación y siembra en el campo, se debe susceptibilidad que presentan dichas plantas al pasar de un ambiente controlado de luz, humedad, temperatura y nutrición a un ambiente natural. En el campo también influye el ataque de plagas, enfermedades y el daño provocado por la intensidad y frecuencia de las lluvias. Las plantas que sobreviven los primeros dos meses en condiciones de campo tienen alta probabilidad de alcanzar la edad productiva.

Se debe evitar sembrar en el campo plantas con un tamaño del vástago inferior a 10 cm, poco desarrollo foliar y poco vigorosas.

3.  Esquema general del proceso de propagación in vitro

Todos los clones comerciales provenientes del CIAT, Colombia, se adaptan y crecen bajo condiciones controladas in vitro y las condiciones ambientales presentes en el campo experimental del CENIAP en la ciudad de Maracay. Sin embargo, es evidente que algunos clones se adaptan con mayor facilidad que otros al proceso de propagación in vitro.

El proceso de propagación in vitro, desde la disección de los segmentos nodales hasta la siembra en el campo, se realiza en un tiempo aproximado de 14 a 15 semanas, y se pueden obtener entre 4 y 5 plantas por cada tallo disectado. El proceso demanda poca mano de obra, permite obtener un material vegetal sano y homogéneo en un tiempo relativamente corto, contribuyendo a mejorar los rendimientos del cultivo y la disminución del uso de pesticidas, con efectos positivos en la conservación del medio ambiente y sostenibilidad de los agroecosistemas.

5. GLOSARIO

Biotecnología: Toda técnica en la que se emplea organismos (o parte de estos), para fabricar o modificar productos, mejorar plantas o animales, o crear microorganismos para usos específicos.

Callo: Estructura indiferenciada y desorganizada de un grupo de células formadas por división celular.

Clon: Todos los individuos derivados de la reproducción vegetativa de un mismo individuo.

Fotoperíodo: Ciclo diario de duración de las condiciones de iluminación y oscuridad a la cual son sometidas las plantas.

Meristema: Porciones de células vegetales ubicadas en un lugar específico de la planta y que se encargan de la formación de los tejidos primarios mediante el proceso de división celular.

Regulador de crecimiento: sustancias asociadas directamente con el crecimiento, diferenciación de tejidos y órganos. Entre ellas son muy importantes para las plantas: las auxinas como el ácido naftalenacético, las citoquininas y giberelinas.

Semilla sexual: es el resultado del proceso de fecundación de las células sexuales y contiene el embrión de la planta que al germinar dará origen a un nuevo individuo.

Termoterapia: medida terapéutica que consiste en someter a la planta a un ciclo diario de calor con la finalidad de inactivar agentes patógenos.

Ashmore S. 1997. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. 67 p.

FAO. 2002. Yuca (Cuadro 28) Anuario de Producción 2001. Roma, Vol. 55 pp: 102

Guo, J., Liu Y. 1994. Rapid propagation of cassava by tissue culture and its application in rural districts in China. The Cassava Biotechnology Network. Proceedings of the Second International Scientific Meeting. Bogor, Indonesia. p 183-189.

Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

Roca W., Beltrán J. 1984. El cultivo de meristemas para la conservación de germoplasma de yuca in vitro. Guía de estudio. Serie 04SC-05.03. Cali, Col. Centro Internacional de Agricultura Tropical.. 44 p.

Roca W., Jayasinghe U. 1982. El cultivo de meristemas para el saneamiento de clones de yuca. Guía de estudio. Serie 04SC-02.05. Cali, Col. Centro Internacional de Agricultura Tropical.. 47 p.