Bibliografía consultada

A continuación se esbozan una serie de conceptos o términos que ayudan a entender las razones por las cuales es posible desarrollar las técnicas serológicas (incluida ELISA),  y darles uso práctico  para la detección o diagnóstico de enfermedades.

El sistema inmunológico, característico de animales superiores, es un complejo mecanismo de defensa por medio del cual, éstos se defienden de infecciones causadas por diferentes microorganismos. Las reacciones de defensa ocurren de diversas formas, empleando numerosos mecanismos, y a los efectos del desarrollo de varias técnicas serológicas, los aspectos claves son el reconocimiento del agente invasor como un cuerpo extraño, y la producción de anticuerpos específicos para su eliminación o neutralización.

Cualquier sustancia, molécula o microorganismo que entra en el torrente sanguíneo de un animal, y que es capaz de inducir en el organismo invadido una reacción de “defensa” o respuesta inmune, es considerado como un antígeno o inmunógeno. Esta respuesta puede ser variada, y uno de esos mecanismos consiste en que, cuando el antígeno entra en el torrente sanguíneo, es procesado y reconocido por grupos de células guardianas conocidas como glóbulos blancos o linfocitos del tipo “B” y “T”, de cuya interacción son producidos los anticuerpos que reconocen el antígeno de manera específica. El sitio del antígeno que es reconocido por un anticuerpo es denominado determinante antigénico o epítope, pudiendo tener el antígeno más de un epítope.

Los anticuerpos policlonales son obtenidos del suero de un animal inoculado con un antígeno que presenta uno o varios sitios antigénicos, y consisten en una población de  anticuerpos que reaccionan o reconocen  más de un epítope. Según el tipo de antígeno y la tecnología utilizada para la producción de métodos de diagnóstico, éstos pueden  ser considerados de mayor o menor especificidad. Los anticuerpos policlonales obtenidos contra un antígeno purificado, eventualmente pueden reaccionar contra componentes de la planta, debido a que restos del antígeno contaminante permanecen en el extracto purificado. Desde el punto de vista práctico, esta es una reacción cruzada inespecífica. La base molecular que explica la especificidad, radica en que es regulada por un mecanismo simple: una célula reconoce un solo antígeno. En la naturaleza, un individuo (e.g. mamífero) puede producir más de 10 millones de anticuerpos diferentes, cada uno frente a un antígeno distinto.   

La misma base del mecanismo de especificidad permitió la obtención de anticuerpos monoclonales, producto de la creatividad humana y cuyo fundamento consiste en  fusionar una sola célula cancerosa, mieloma (capaz de vivir indefinidamente en un medio de cultivo) con un linfocito B aislado (que produce anticuerpos frente a un solo epítope, y es obtenido de ratones) para formar un hibridoma: es decir, un híbrido celular que vive por siempre y que además, produce anticuerpos.

Con los anteriores conceptos en mente, podemos decir que los anticuerpos policlonales no son más que la suma o mezcla de muchos anticuerpos monoclonales, cada uno reaccionando frente a un epítope distinto. Debido a que los anticuerpos monoclonales son cuidadosamente seleccionados en un proceso de validación y control de calidad, sólo reaccionan contra un antígeno que es bien conocido y, por lo tanto, son altamente específicos. Dependiendo de la selección del anticuerpo monoclonal, este puede ser, desde el punto de vista del espectro de detección, específico para diferenciar razas de un mismo patógeno, o genérico para identificar grupos de patógenos en un determinado nivel  taxonómico. Este criterio también es aplicable a los anticuerpos policlonales, sólo que en el caso de los anticuerpos monoclonales, la reacción contra componentes de la planta es eliminada totalmente.

 La especificidad del anticuerpo policlonal o monoclonal depende de la distribución del antígeno en la naturaleza, si está o no presente en individuos pertenecientes a diferentes grupos taxonómicos, o si presenta variantes en su estructura en diferentes organismos. Así, aquellos más o menos semejantes, pero no idénticos, pueden ser reconocidos en mayor o menor grado como tales. Esta también puede considerarse como una reacción cruzada, en cuyo caso no se produce una reacción positiva falsa o inespecífica, sino una reacción genérica que revela relaciones genéticas entre el organismo detectado y el que sirvió como antígeno para la producción de los anticuerpos que se usan en el ensayo de ELISA. Las características anteriores producen una variada gama de posibles respuestas e interpretaciones,  por lo cual estas técnicas se deben  usar  con criterio práctico y adecuado contexto,  que les permita juzgar sus alcances y limitaciones.

Los anticuerpos obtenidos para el desarrollo de métodos de detección o diagnóstico son purificados a partir del suero anti-antígeno (suero inmune o antisuero). Los anticuerpos obtenidos con estos fines están constituidos completamente por inmunoglobulinas G o IgG, debido a que son las moléculas especificas que exhiben las mejores propiedades para el procesamiento, es decir para marcarlas con moléculas tales como biotina o enzimas para producir una reacción de interés en un inmunoensayo. El diagnóstico de virus y otros patógenos, de plantas, basado en estos métodos presenta numerosas variantes y presentaciones disponibles a nivel comercial.

Para el caso de que la técnica utilice como soporte una fase sólida (placa de microtitulación), en la cual se añaden secuencialmente anticuerpos, la muestra y otros reactivos, la reacción final tiene como resultado un producto soluble que permite la  detección del antígeno a consecuencia del cambio de color del sustrato degradado por la enzima. (ELISA clásica).

Cuando la técnica empleada utiliza como fase sólida una membrana de nylon o nitrocelulosa, y la reacción final que permite la detección del antígeno produce un precipitado insoluble de color característico sobre la muestra (de la cual se ha efectuado una impresión directa o colocado una gota de extracto), es denominada entonces,  inmunoimpresión o dot-blot, aunque esencialmente es un inmunoensayo del tipo ELISA, ya que los pasos a seguir son los mismos. El cambio de color es indicativo de la presencia de virus en la muestra, y la intensidad de color es proporcional a la concentración de antígeno viral. Sin embargo, hay ocasiones en que ocurren cambios en el color que apenas permiten diferenciar los controles, o los mismos ocurren donde se supone no debe ocurrir reacción alguna. Esto es lo que se conoce como ruido de fondo, señal inespecífica o “background”.

Esta reacción puede tener diferentes causas, en estos casos, aún cuando la prueba haya sido ejecutada correctamente, la apreciación cualitativa o a “ojo desnudo” no es de mucha utilidad para el diagnóstico. Para el caso de realizar una prueba de ELISA con producto soluble, es conveniente disponer de un espectrofotómetro o lector de placas de microtitulación, ya que se obtienen valores numéricos y se pueden efectuar las correcciones sustrayendo los valores correspondientes al blanco de los controles sanos que ofrecen la reacción inespecífica que es común a toda la placa.

A continuación se enumeran algunas de las causas más comunes para la ocurrencia de señal inespecífica:

·        Elevada variabilidad de absorbancia entre los pozos de una placa. Actualmente es poco frecuente debido a que cada vez se controla mejor este factor, incluso algunos fabricantes ofrecen un certificado de análisis con un coeficiente de variación estadísticamente verificable.

·        Anticuerpos (policlonales) obtenidos a partir de virus purificado parcialmente que conservó antígenos de la planta y que por lo tanto también reaccionan contra antígenos de planta sana.

·        Uso de una concentración elevada de  reactivos (particularmente del  conjugado).

·        Sustrato degradado por enzimas exógenas (p.ej.: la grasa y el sudor de las manos contienen cantidades reactivas de fosfatasa alcalina que pueden degradar el sustrato y conducir a falsos positivos).

·        Sustrato almacenado por tiempo prolongado y parcialmente  ya degradado.

·        Ejecución deficiente de la técnica (escasa destreza, adición errática de los reactivos por el uso de instrumentos no ajustados, la dilución de los reactivos está en un rango en que la reacción enzimática no es lineal, etc.)

Muchas de estas reacciones pueden ser identificadas y corregidas mediante la inclusión de controles experimentales adecuados, es decir: un control de muestra positivo (enfermo), un control de muestra negativo (sano) y un control negativo absoluto (sólo tampón de extracción, son recomendables. La inclusión de controles positivos de patógenos relacionados y no relacionados, no es requerida, pero es aconsejable por la información de especificidad que se obtiene, dándole mayor confiabilidad a la interpretación de los resultados de la prueba.

Es recomendable efectuar diluciones de calibración al iniciar el trabajo con un lote de anticuerpos. Existe la tendencia general a omitir este paso debido al interés de economizar reactivos, pero se debe hacer para contrastar con las recomendaciones del fabricante, ya que desde la producción del lote, pueden ocurrir alteraciones en las condiciones de almacenamiento y/o transporte que afectan la calidad de los reactivos y consecuentemente  la reacción.

La técnica que describiremos a continuación está basada en el inmunoensayo de doble sandwich de anticuerpos y detección indirecta, cuyas siglas en inglés son: DASI-ELISA (Double Antibody Sandwich Indirect-Enzime Linked ImmunoSorbent Assay).

En el laboratorio de virología del CENIAP se utiliza rutinariamente esta técnica para la detección del virus de la tristeza de los cítricos (CTV), utilizando una mezcla de anticuerpos monoclonales comerciales (3CA5 + 3DF1), que reconocen todas las variantes del virus descritas hasta el presente. Debido a que es una de las variantes con más pasos a seguir, es una referencia para la ejecución de otras,  siguiendo las instrucciones de diferentes fabricantes o proveedores. Se incluyen comentarios para facilitar la comprensión del método.

Los volúmenes de reacción son los máximos utilizables con fines didácticos, y las diluciones son referidas a un factor de 1:1000, pero esta información puede cambiar según las especificaciones del fabricante. Otros sistemas de detección pueden utilizar diferentes tampones, que han sido validados para el sistema biológico objeto de estudio.

Los anticuerpos que se añaden a la placa antes que la muestra son denominados anticuerpos primarios, de sensibilización o de captura. Los orificios de las placas son sensibilizados con 200 µl de solución de IgG diluída 1:1000 en tampón carbonato a pH 9,6, dejando en incubación por 2 h  a 37°C, o 18 h a 4ºC. Las placas se enjuagan 3 veces con tampón fosfato salino + Tween 20 (PBS-T),  quedando listas para la adición de las  muestras (Fig. 1A). Cuando termina el tiempo de incubación, se puede recuperar la solución con el anticuerpo de captura  y reutilizarlo para otra reacción siempre y cuando sea pronto. Una vez sensibilizada una placa, puede permanecer viable a 4°C y cubierta para evitar la evaporación hasta su uso luego de pocos días (no se recomienda más de una semana).   

Figura 1.Representación esquemática de la técnica de DASI-ELISA doble sandwich de anticuerpos para la detección indirecta del CTV con anticuerpos monoclonales bionilados A:Sensibilización de la placa (anticuerpo de captura: ) B: Adición de antígeno C: Adición de anticuerpo biotinilado (primer conjugado) D: Adición del segundo conjugado (estreptavidina-fosfatasa alcalina: ) E: Adición del sustrato (revelado) F: Detención de la reacción con NAOH 3N. La lectura se hace luego a simple vista o con un espectrofotómetro.

A cada pozo de la placa, se añaden 200 µl de antígeno o muestra convenientemente macerada y diluida (La dilución puede variar desde 1:1 hasta 1:100 en  peso: volumen,  según  calibración previa) en tampón de extracción (Fig. 1B). Se debe incluir los respectivos controles o testigos (tejido enfermo, sano y  tampón sin  muestra). La placa se puede tapar con plástico adhesivo con la finalidad de prevenir evaporación y se deja en incubación a temperatura ambiente, o a 37°C de 2 a 4 horas, o durante la noche a 4ºC. Luego, la placa es vaciada rápida y cuidadosamente, enjuagando posteriormente tres veces con PBS-T. En nuestro laboratorio se usan dos pozos por muestra, con la finalidad de poder analizar estadísticamente los resultados.

Se añaden 200 µl/pozo de los anticuerpos secundarios biotinilados diluidos 1:1000 en tampón de extracción. Se dejan incubar por 3 horas a 37ºC, y posteriormente se lavan cuidadosamente como en pasos anteriores (Fig. 1C).

La conjugación del anticuerpo de detección con biotina permite que este sea detectado en un paso posterior, por un conjugado enzimático de estreptavidina, el cual degrada un sustrato específico y posibilita la detección de antígenos en muy bajas concentraciones, dado el carácter amplificador que el uso de los conjugados de biotina y estreptavidina le confieren al ensayo. El hecho de que el anticuerpo secundario sea detectado por el segundo conjugado, es lo que define la detección indirecta del virus.   

Luego del enjuague, se agrega 200 µl/pozo de estreptavidina conjugada con fosfatasa  alcalina  diluida 1:1000 en tampón fosfato salino, dejando en incubación por una hora a temperatura ambiente (Fig. 1D).  

A continuación, se añade 200 µl/pozo del sustrato de la enzima (para-nitro fenil fosfato de sodio, pnpp-2Na) a  razón de 1 mg/ml en una solución acuosa de dietanolamina 10% a pH 9,8 (Fig. 1E). Se deja incubar la reacción enzimática por 30 minutos, luego de lo cual es detenida por adición de NaOH a 3N, a razón de 50 µl/pozo (Fig. 1F). El tiempo de incubación puede variar y se recomienda se haga en la oscuridad. El tampón sustrato se debe mantener protegido de la luz directa y cuando el sustrato es añadido al tampón, debe utilizarse inmediatamente.   

Las placas están listas para ser analizadas cuando a simple vista se pueda observar una reacción distinguible entre los controles de la placa. Alternativamente se pueden analizar con el espectrofotómetro. Cuando se usa fosfatasa alcalina y pnpp-2Na como complejo enzima-sustrato, se efectúa la lectura a 405 nm. La reacción puede hacerse evidente de manera casi inmediata, o puede demorar horas obedeciendo a diversos factores.

En caso de efectuar la lectura directamente debe haber bajo nivel de reacción inespecífica y la coloración debe tener una intensidad aceptable. Además, se recomienda que la lectura sea efectuada sobre un fondo blanco con luz incidente o al transluz, que sea efectuada por una misma persona y que se haya familiarizado con los diferentes resultados posibles.  

El establecimiento del punto de corte o umbral de decisión para calificar si una muestra está sana o infectada, es relativamente arbitrario y se ha escrito mucho al respecto. Aún cuando la prueba de ELISA es muy sensible para el caso de especimenes asintomáticos o que presenten síntomas no específicos, no es infalible. Sin embargo, ofrece un medio objetivo aceptado internacionalmente en muchos sistemas de control de calidad para la determinación de la condición sanitaria de una muestra.  

En el laboratorio de Virología Vegetal del CENIAP, se consideran muestras enfermas o positivas aquellas cuyo promedio de lectura de absorbancia o densidad óptica (D.O), es mayor o igual  al promedio de la lectura del testigo negativo más dos veces la desviación estandard del mismo {Prom D.O ≥ (2σ_n-1)}, con la finalidad de minimizar la probabilidad de ocurrencia de falsos negativos, es decir, escapes en la detección. Este punto de corte es considerado estricto y requiere tener un buen control de error experimental, lo cual no siempre es factible. Sin embargo, se puede ser menos estricto según el motivo del diagnóstico. Otros criterios pueden ser: {Prom D.O ≥ (3σ_n-1)} {Prom D.O ≥ (4σ_n-1)}, o sencillamente 10 veces el valor de la D.O del control sano. Algunos protocolos comerciales incluyen el procedimiento estadístico recomendado por el fabricante.

En general, se recomienda establecer un balance de especificidad del sistema de detección y rigurosidad requerida en el ensayo, ya que no es igual la detección de una enfermedad en el campo para una enfermedad endémica, que el control de calidad en una planta o categoría de semilla de Fundación, o la detección de una enfermedad de interés cuarentenario en un lote de semilla importada.

La incorporación progresiva del uso de la técnica de ELISA en Venezuela para la detección de patógenos en plantas, es una necesidad a la cual no se le ha dado la importancia que tiene, en función de su utilidad para mejorar el control de calidad fitosanitaria de semilla y material de propagación vegetativa.

A pesar de tener una estructura de costos y escalabilidad razonables, su utilización es todavía marginal, asociada a proyectos de investigación y eventualmente en servicios solicitados por un número muy reducido de productores que han comprendido  que se genera valor agregado  al sistema de producción,  cuando se  conoce objetivamente el estado fitosanitario de la plantación o de  un lote de plantas que pueden servir como donadoras de yemas libres de un determinado patógeno. 

Es deseable incluso, la incorporación de la técnica de ELISA en el análisis de calidad fitosanitaria de semillas certificadas por la institución. Sin embargo, hay un largo camino por transitar en el cual se deberá definir cuales serán los patógenos a incluir en el esquema de control y variables operacionales, como intensidad de muestreo y niveles de tolerancia basada en la evaluación de normas internacionales ya en funcionamiento y ajustarlas a las condiciones de nuestro país.

Dependencias como el Servicio Autónomo de Sanidad Agropecuaria, deben ser fortalecidas en la División de Sanidad Vegetal para incorporar rutinariamente esta tecnología en puertos y aeropuertos para el análisis de muestras frente a enfermedades exóticas.

Los bajos índices de utilización de esta técnica, se explican por la simple aplicación de la ley de oferta y demanda, en la cual, la baja demanda de control de calidad con instrumentos tecnológicos en el país en el sector vegetal (ya sea de particulares o agencias del gobierno), limita la ampliación de la oferta tecnológica, a pesar de contar el país con instituciones con competencias legales y capacidades técnicas para ello. Un medio para corregir esta desviación negativa del mercado, podría considerar la inclusión de una norma de obligatorio cumplimiento y cuya aplicación sea factible técnica y económicamente. 

No se descarta, el uso de otras técnicas complementarias basadas en la biología molecular, como la hibridación de ácidos nucléicos y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las cuales en el futuro tendrán su espacio en la red nacional de laboratorios dedicados al diagnóstico fitopatológico, en conjunto con la implementación de la técnica de ELISA, cuya alta sensibilidad y especificidad permitirá; mejorar los niveles de control de la calidad fitosanitaria como respaldo a las políticas que adelante el estado venezolano.

 

^	Bibliografía consultada

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Nota de los editores
Este artículo fue revisado y avalado por:
Efraín Salazar 
Pedro Ramos
Comentarios a este artículo a ceniaphoy@inia.gov.ve .Asunto CH10: Implementación de la técnica de ELISA para la detección de virus y otros patógenos en plantas en Venezuela.