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Agronomía Tropical 57(1): 45-50. 2007 EVALUACIÓN
DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE SUBESPECIES DE ARROZ USANDO MARCADORES
MICROSATÉLITALES Y AFLP1
Evaluation
of genetic diversity in rice subespecies using AFLP and microsatellite
markers1
Erika
Arnao*, Nohelia Rodríguez**, Patricio Hinrinsen***, Yorman Jayaro*,
Catalina Ramis**** e Iris Pérez-Almeida** 1
Trabajo financiado bajo el Proyecto BID-FONACIT II (Subproyecto Nº
2004000369). |
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RESUMEN Los
marcadores moleculares representan una herramienta poderosa en la
evaluación de la diversidad genética y en la determinación de
identidad, especialmente en variedades de base genética estrecha
como el arroz. El objetivo de este estudio fue evaluar la diversidad
genética de las subespecies de arroz Indica y Japónica, mediante
el uso de marcadores microsatélite y AFLP. Para ello, se evaluaron
12 variedades de arroz venezolanas y 12 variedades chilenas
pertenecientes a las subespecies Indica y Japonica, respectivamente,
con 13 marcadores microsatélites (SSR) y 5 combinaciones de
primers AFLP. La presencia (1) y ausencia (0) de bandas para cada
SSR y combinación de primers AFLP fue registrada para cada
individuo y luego convertidos a matrices de similitud y distancia genética
para los SSR y AFLP, respectivamente, a partir de la cual se
construyó un cluster por el método UPGMA y se realizó el análisis
de coordenadas principales. Con los 13 SSR se obtuvo un total de 70
alelos, siendo el promedio de 5,64 alelos por locus, y el contenido
de información polimórfica de 0,60. Mientras que, con las 5
combinaciones de AFLP se generaron 82 bandas, de las cuales 43
(51,8%) resultaron polimórficas. Ambos métodos de agrupamiento
clasificaron las variedades en 2 grupos: el primero correspondió
a las variedades de la subespecie Japónica (chilenas) y el segundo
a la Indica (venezolanas). El grupo Japónica mostró menor
diversidad genética que el grupo de Indica, y en general todas las
variedades pudieron ser distinguidas. Los resultados sugieren
que un pequeño número de marcadores genera suficiente información
para estimar diversidad genética entre subespecies de arroz e
identificar variedades. Palabras
Clave:
AFLP; microsatélite; Oryza sativa L.; diversidad genética. SUMMARY Molecular
markers represent a powerful tool for genetic diversity assessment and
identity determination especially in genetic narrow based rice
varieties. This study aimed to assess the genetic diversity of Indica
and Japonica rice subspecies using SSR molecular markers and AFLPs. We
evaluated 12 rice Venezuelan varieties (Indica) and 12 Chilean
varieties (Japonica) with 13 microsatellite markers (SSR) and four
AFLP primer combinations. Presence (1) and absence (0) of bands for
each microsatellite (SSR) and AFLP primer combination were scored for
each variety, and then converted into similarity and distance genetic
matrix for SSR and AFLP, respectively, to construct a cluster by the
UPGMA method. Also a Principal Component Analysis was performed. A
total of 70 alleles were obtained from the 13 SSRs, with an average of
5,64 alleles per locus, and a polymorphic information content of 0,60.
A total of 82 bands were generated from four AFLPs combinations, from
which 43 (51,8%) resulted polymorphic. Both grouping methods
classified the varieties in two groups: first one corresponded to the
Japonica subspecies varieties (Chilean) and the second to the indica
subspecies varieties (Venezuelan). Japonica group showed a higher
genetic diversity than the Indica group, and in general all varieties
could be differentiated. Our results suggest that a small number of
markers can generate enough amount of information useful to estimate
genetic diversity between rice subspecies and to identify varieties. Key
Words:
AFLPs; microsatellites; Oryza sativa L.; genetic diversity. INTRODUCCIÓN
La
colección mundial de germoplasma de arroz silvestre y cultivado ha
hecho una gran contribución en el mejoramiento de este cultivo. La
especie de arroz, Oryza sativa esta compuesta por dos
subespecies: Indica y Japónica (Oka, 1998). Indica es
una subespecie predominantemente tropical, y Japónica constituye
una subespecie de tipo tropical y templado, ampliamente sembrada al
este de Asia, norte y sur de América, Australia, Norte mediterráneo
de África y Europa, representando alrededor del 20% de la producción
mundial de arroz (Mackill, 1995). El
cruce entre diferentes subespecies frecuentemente resulta en
problemas de esterilidad en los híbridos y sus progenies, ruptura de
los bloques de ligamiento y de combinaciones de genes favorables, y
arrastre genético (Ikehashi y Araki, 1986). La reducida recombinación
y la distorsión en la segregación resultante de hibridaciones
amplias pueden ocasionar dificultad en la selección de recombinantes
deseables durante el proceso de mejoramiento, por ello los
mejoradores generalmente usan líneas dentro de la misma
subespecie o grupo para realizar los cruces. Gracias
al uso de la biotecnología se han abierto mucho más las
posibilidades de realizar cruces intra e interespecíficos, y con
los marcadores moleculares muchas de las dificultades mencionadas
para la hibridación han sido solucionadas. Sin embargo, para la
aplicación de selección asistida por marcadores moleculares dentro
de una subespecie es importante obtener información de la diversidad
genética dentro de las subespecies de arroz (Temnykh et al.,
2000). El presente estudio tiene como objetivo evaluar la
diversidad genética de las subespecies de arroz Indica y Japónica,
mediante el uso de marcadores moleculares del tipo microsatélite
y AFLP. MATERIALES
Y MÉTODOS
Material
Vegetal Se
utilizaron 12 variedades de arroz venezolanas pertenecientes a la
subespecie Indica y 12 variedades de arroz chilenas subespecie
Japónica (Cuadro 1). La evaluación molecular de los 24 materiales
con los marcadores SSR y AFLP se llevó a cabo en el Laboratorio de
Biotecnología del INIA-Chile y en el Laboratorio de Biología
Molecular de Fundación DANAC. Extracción
del ADN Se
realizó siguiendo la metodología de extracción con CTAB (2%)
descrita por Dellaporta et al. (1983) con modificaciones menores. La calidad y cantidad del ADN se
verificó en geles de agarosa al 0,8% utilizando como referencia ADN
del bacteriófago Lambda. La concentración de ADN se ajustó a 25 ng
µl-1 con agua ultrapura.
Evaluación
de los SSR En
los 24 materiales de arroz se evaluaron 13 marcadores microsatélites,
distribuidos en 11 de los 12 cromosomas del arroz, denominados: RM222,
RM541, RM144, RM219, RM551, RM547, RM440, RM11, RM185, RM336, RM415,
RM545, RM580. La amplificación del ADN vía reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) se realizó en un volumen final de 20 µl usando: 2
µl ADN, 2 µl de buffer (10x), 2 µl MgCl2 (25 mM), 1,3 µl de dNTPs (2,5 mM), 2 µl Primer R y F (5 mM)
y 0,5 µl de Taq polimerasa. Los
perfiles de temperatura fueron los siguientes: 94 ºC por 5 min,
seguido por 34 ciclos a 94 ºC por 45 seg; 56 ºC por 2 min y 72 ºC
por 15 seg. Finalmente un ciclo de extensión final a 72 ºC por 5
min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis
en geles de poliacrilamida al 6% y teñidos con nitrato de plata
usando el kit Promega (SILVER SECUENCE™). Evaluación
de los AFLP El
análisis con marcadores AFLP se desarrolló según el protocolo de
Vos et al. (1995) con pocas modificaciones y constó de los
siguientes pasos: digestión del ADN, ligación de los adaptadores,
amplificación preselectiva, amplificación selectiva y separación
de los fragmentos. Para la digestión del ADN genómico se usó la
combinación de las endonucleasas de restricción EcoRI/MseI. Los
primers usados para la amplificación preselectiva tenían las
siguientes secuencias: EcoRI + n: 5´GAC TGC GTA CCA ATT C 3´
y MseI + n: 5´GAT GAG TCC TGA GTA A 3´ y los perfiles de
temperatura para la amplificación fueron los siguientes: 94 ºC
por 2 min seguido de 20 ciclos repetitivos de 94 ºC por 30 seg, 55
ºC por 1 min y 72 ºC por 1 min con una extensión final de 75 ºC
por 5 min. Los productos amplificados fueron diluidos 1/100 para
realizar la amplificación selectiva. En
el caso de la amplificación selectiva se usaron 5 combinaciones
de primers los cuales tenían la misma secuencia que los usados para
la amplificación preselectiva más 3 nucleótidos selectivos: E:
AAC y M: GAT; E: AAC y M: GAC; E: ATC y M: GCA; E: AAC y M: GAC y E:
AAT y M:GCA. Los perfiles de temperatura en este paso fueron los
siguientes: 94 ºC por 4 min seguido de 12 ciclos de 94 ºC por 30
seg, 65 ºC por 30 seg (disminuyendo 0,7 ºC por ciclo hasta llegar
a 56 ºC) y 72 ºC por 1 min. Luego 26 ciclos de 94 ºC por 30 seg, 56
ºC por 30 seg y 72 ºC por 1 min. Finalizando con una extensión de
72 ºC por 5 min. La separación de los fragmentos y tinción fue
similar a la realizada para los SSR. Análisis
estadístico Las
bandas polimórficas para los marcadores SSR y AFLP fueron genotipadas
manualmente como un código binario con “1” para presencia y
“0” para ausencia. Las bandas monomórficas no fueron consideradas.
Las asociaciones entre las subespecies (Indica y Japónica) fueron
evaluadas usando los coeficientes de similitud de Dice y de
distancia genética de Nei para los AFLP y SSR, respectivamente. Las
matrices fueron sujetas al análisis de cluster empleando el método
de agrupamiento por pares no ponderadas usando la media aritmética
(UPGMA) proporcionado por el programa NTSYSpc, versión 2,1 (Exeter
Software Co., New York). En
el caso de los microsatélites se realizó también el análisis de
coordenadas principales, se contabilizó el número de alelos para
cada marcador y se determinó el contenido de información polimórfica
(PIC) usando la fórmula 1- Spi2,
donde pi corresponde a la frecuencia alélica (Powell et al.,
1996). RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Los
13 SSR generaron un total de 70 alelos, siendo el promedio de 5,64
alelos por locus, y el contenido de información polimórfica de
0,60 (Cuadro 2). Por su parte, las 5 combinaciones de AFLP se generaron
82 bandas, de las cuales 43 (51,8%) resultaron polimórficas.
Con
ambos marcadores moleculares (SSR y AFLP) se obtuvo suficiente
polimorfismo para diferenciar claramente las dos subespecies. La
Figura 1 muestra los dendrogramas obtenidos con ambos tipos de
marcadores y la Figura 2 el gráfico de coordenadas principales
para los SSR. En ambas figuras se aprecia una clara diferenciación
de las variedades en dos grupos, correspondientes a cada una de
las subespecies. En
el dendrograma generado con la distancia genética de Nei se aprecia
que la máxima distancia entre las variedades Japónica es
de aproximadamente 0,57, mientras que para las variedades Indica este
valor es cercano a 0,90, lo cual indica una mayor diversidad dentro de
las variedades de esta última subespecie. Este hecho coincide con
estudios previos (Mackill et al., 1995; Zhang et al.,
1992). Aguirre et al. (2005), hacen referencia a la alta homogeneidad
genética de las variedades chilenas de arroz, debido a un reducido
número de progenitores (5 a 6) con un amplio aporte en el genoma de
las mismas.
Las
variedades Indica liberadas en Venezuela presentan una mayor
diversidad respecto al número de progenitores que intervienen en
su constitución. El Cuadro 3 presenta los progenitores con un aporte
mayor al 3% del genoma de algunas de las variedades incluidas en el
estudio, elaborado a partir de la genealogía de las variedades
obtenidas en la base de datos International Rice Information System,
IRIS (IRRI, 2006). Aún cuando la mayor parte de los progenitores
provienen de Asia, parecen aportar una mayor diversidad, tal como le
reflejan las Figuras 1 y 2.
Este
aporte se debe a que dichas variedades son a su vez progenitoras de
IR8, cultivar emblema de la revolución verde que fue ampliamente
utilizado en cruzamientos a escala mundial, luego de su impacto a
partir de la década de 1970. La
variedad Fundarroz PN1 posee un menor aporte de estos progenitores
(Cuadro 3), lo cual pudiese ser una causa de su menor similitud
respecto al resto de las variedades. Este hecho pareciera ser un
indicio de que las variedades tradicionales venezolanas o con mayor
tiempo en el mercado poseen un considerable aporte de los progenitores
de IR8, mientras que variedades más recientes pudiesen haber
disminuido la contribución de esta fuente, debido a la incorporación
de nuevos progenitores. No obstante, son necesarios estudios de la
genealogía de las variedades recientes para confirmar este hecho. Dos
marcadores SSR resultaron ideales para diferenciar las 2
subespecies, ya que los cultivares Indica presentaron alelos que
estaban ausentes en los cultivares Japónicas y viceversa.
El marcador RM222 presentó 5 alelos en los 24 materiales de arroz de los cuales uno estuvo presente en todos los Japónica y ausentes en los Indica. Con el marcador RM219 se visualizaron 5 alelos, de los cuales 2 fueron exclusivos de las variedades Japónica y dos de las Indica. Algunos
de los SSR presentaron alelos únicos que permitieron la
identificación de variedades. Por ejemplo, los alelos 4 y 5 del SSR
222 diferenciaron las variedades Cimarrón y Fonaiap 2000,
respectivamente. El
Cuadro 4 muestra la información de los alelos de algunos SSR que
fueron específicos para algunas de las variedades. En
el caso de los AFLP sólo las combinaciones de primers selectivos: E:
AAC y M: GAT, y E: AAT y M: GCA presentaron alelos diferenciales para
las subespecies. Ninguna de las combinaciones presentó alelos
únicos para las variedades.
BIBLIOGRAFÍA
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